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请教PCR高手解答电泳结果分析错误原因

发布时间:2019-08-24 18:20 来源:未知 编辑:admin

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  1.从血液中提取核酸,不能用肝素作抗凝剂,否则会影响后续的PCR反应,建议使用ACD抗凝剂,具体配方可网上百度,只需柠檬酸、柠檬酸钠和NaAc(好像是这三样,记不清了)。

  2. 楼主没说清楚你是做的是普通的PCR(模板DNA)还是RT-PCR(模板RNA)。既然是公司提取的模板,PCR结果一般情况下应该不会受DNA的影响,如果是RT-PCR,质量再好的RNA再使用前都应该跑电泳看看有没降解,而且建议RNA分装保存,避免反复冻融。如果使用前保存完好,应该也不会影响到实验结果。

  3. 从第一张图中可以看出,你做PCR的手法也许还不够熟练。在混合PCR反应体系时,若你是在同一管中混匀所有组分,再分装到不同PCR管中,同样的条件应该出现同样的结果,如果结果不同则表明可能PCR仪不够稳定,相同温度下不同孔的温度差异较大;若你是在各个PCR管中分别混合PCR体系不同组分的话,同样的条件出现不同的结果可能的原因就比较难分析了,但手法不熟练可能是最大的影响因素,也就是说,虽然你在每个PCR管中加入了同样的东西,但是由于你加样时微小的差异导致了各个管中PCR体系的差异,最后产生了不同的结果,例如图一中左边只有一个出了条带,右边三条带亮度不同(扩增出的量不同,与模板、引物加的多少有关),例如图二中147、258、369之间的巨大差异,还有就是图一右半边和图二456同样条件出现的完全不同的结果。这种情况下需要先使用第一种方法混匀再分装,保证每管中的PCR体系相同,再寻找其他原因。

  4. 梯度PCR不是以1度为梯度的PCR,如果你用梯度PCR设计梯度的话,你会发现,随着你设置的退火温度范围不同,每个梯度温度都会有改变,而且是不规律的,这都是仪器自己设定的,你可以根据自己的实验需要调整温度范围,直至出现满意的温度为止。所以虽然你第二次实验只是在第一次实验的基础上简单增减了1度,却出现了很不可思议的结果。其实有些敏感的引物,退火温度变化零点几度结果可能就是有和无的差别了。

  5. Taq酶和引物没有你想象的那么脆弱。试剂公司的人曾跟我讲过,他们检测一种新研制的taq酶时都是室温放置一天后在做PCR看效果如何的,如果没什么变化就算合格,可见你的taq酶如果是新的又没污染什么蛋白酶之类的东西应该是没问题的。引物就更稳定了,以前我借师姐的引物做PCR,她自己用都是合成回来直接全部溶解,然后直接放在1.5的离心管里,随时冻融了就用,她用完都放了一年半载了,我再拿来用依然没问题,出来的条带还很漂亮,所以你再怎么反复冻融都不会影响引物的,除非你的引物污染了DNA酶等。

  6. 图二中最下面的肯定是引物二聚体了,出现这个东西最大的可能性就是你加入的引物过多了。建议下次适当减少用量,一般加1ul就不少了,如果你加1ul还是有就试试0.5或0.3吧。还可以等PCR仪的温度上到80度以上再把PCR管放进去,这样高温的条件下就可以避免第一轮循环时大量的引物二聚体形成了。还有就是延伸时间太长也容易出引物二聚体,尤其是最后一次延伸,可以适当缩短些时间试试。50bp附近的条带看起来像非特异扩增片段,因为每一个泳道上都出现这一条带了。有可能是你这个引物的特异性不是很好,也可能这个温度范围容易造成非特异带的产生。建议你先做一个55到65的梯度,找出非特异带最少的范围,再做梯度,逐步缩小退火温度范围。如果实在没有非特异带少的温度范围,那么考虑重新设计引物。如果你的PCR产物只是用来验证某一实验结果,不做后续研究用,那么有一条非特异条带也可以。如果还要做其他的研究用,最好没有非特异带,或者做胶回收,把目的片段回收了,除去非特异带的干扰。

  7. Maker跑成W型不要紧,只要跑开了就可以了啊。以后可以尽量把maker点在中间,这样跑出来会很漂亮。依我看,图二中245689都有条带,只是清晰度的差别很大,这是照片的问题,可以在拍照时调整一下亮度对比度什么的,让自己先看清条带再拍照。梯度PCR仪其实并不复杂,找个会用的人教你一下就ok啦。

  8. 个人认为用2.0%的胶,130V跑50min没啥问题,就算是RT-PCR产物也无妨,因为PCR的产物都是DNA,不存在RNA降解的可能性。不过看图二的样子,少跑十来分钟应该也可以,只要maker跑开了就可以了,不用跑的离点样空那么远。

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