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rescue 基因转染多长时间

发布时间:2019-07-27 00:59 来源:未知 编辑:admin

  2016-07-2920:57 来源:生物学霸 点击次数:143在基础医学与生物学研究领域中,基因干预越来越重要,方法也越来越多。如何实现细胞和动物水平上的基因高表达或抑制,我们需要精准、高效的基因转染方法。 目前动物体内基因转染方式,广义上来说有两种: 1、基因工程小鼠 基因工程小鼠,是经典的动物体内基因干预模型,包括转基因小鼠(TGmouse,transgeneticmouse),敲除小鼠(KOmouse,Konckoutmouse),敲入小鼠(KImouse,Knockinmouse)。 基因工程小鼠对生物医药研究发挥了巨大的作用,但也存在不少的限制因素: (1)从受精卵开始的基因干预,经过长时间发育的复杂代偿,所表现出来的功能表型和实际的基因功能表型可能存在巨大的偏差。2015年8月份,nature杂志发表了DidierStainier研究小组发现受精卵敲除egfl7基因和成年后用RNA干扰阻断egfl7的表达,模式生物所得到的表型完全不一样。 (2)基因工程小鼠周期长,成本高。君忆否,动物房里伺候老鼠,一把屎一把尿拉扯它,给它找对象,还得帮它养孩子。(哭死) 2、病毒载体介导的动物体内基因转染 目前最主流的病毒载体工具有三种:腺病毒(adenovirus),慢病毒(lentivirus),腺相关病毒(AAV,adenovirusassociatedvirus)。 相比较基因工程小鼠的局限性,病毒载体优势明显: ●避免了发育代偿的问题。 ●周期和维持成本要小得多。 ●病毒载体介导的基因干预可以在动物造模后进行,作为一个基因治疗干预手段,与临床更加接近,而不仅仅是完成基因功能研究。 图:AAVinvivo实例——在体感染小鼠海马组织对比 (1)慢病毒 慢病毒由于其本身的基因组整合特性,长时间表达,因而在细胞基因转染中被广泛用于建立基因稳转细胞系。但在动物活体(invivo)水平,慢病毒相比腺病毒和腺相关病毒,劣势明显。 a.慢病毒滴度的限制:动物体内基因转染对注射的活性病毒载体总量及注射体积都有极高要求,而注射体积往往是容易被忽略但实际上限制最大的因素,如小鼠脑室注射,注射的体积不能超过2μL。同样的病毒注射总量,病毒滴度越高则注射的体积数越小,而比慢病毒由于滴度限制(108~109TU/mL),单位体积所含的病毒活性病毒颗粒数相比腺病毒和AAV少得多,因此在动物体内(invivo)基因转染的应用上,慢病毒的转染效果不理想。 b.潜在致瘤性:慢病毒整合到宿主细胞的基因组中,形成稳定的持续表达。虽然普遍认为慢病毒是相对安全的,但这种随机插入仍会有致瘤的潜在危险性。 (2)腺病毒 腺病毒载体在动物基因转染实验中,特点突出且鲜明: a.腺病毒能够在注射干预的72小时即开始强烈表达,因而对于一些干预窗口特别短的急性体内基因转染,腺病毒有着显著的优势。 b.腺病毒载体在体内的表达时程为2~4周,四周后表达基因表达衰减明显;如需要延长表达时间,可在第一次注射两周后进行第二次注射。 图:不同剂量的腺病毒载体体内基因转染的起效时间曲线Vol.91,pp.215-219,January1994/ c.腺病毒有较高的免疫原性,通过系统性给药比较容易激活免疫系统产生相应的抗体,影响体内基因转染效果,因此腺病毒载体的是目的脏器的局部注射(肝脏例外)。最常见的腺病毒载体给药方式为原位多点注射,比如骨骼肌,心肌,肿瘤组织等,一般选取3~5个注射点,每个点10L左右的注射量。 (3)腺相关病毒(AAV):动物体内基因转染神器 腺相关病毒,即AAV,是最优秀最安全的动物体内基因转染工具,相比较慢病毒等其他病毒载体,AAV有滴度高,免疫原性极低,表达时间长,无任何致病性及病理毒理作用,病毒颗粒小,扩散范围广,多血清型且有相对组织亲和性等优点。 AAV有多种血清型,每种血清型的靶器官亲和力各不相同,这一点决定了AAV与其他病毒载体相比,更具有选择性。汉恒生物在原有的AAV血清型基础上,开发出器官亲和型。

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