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病毒转染细胞细胞一般要融合比多少

发布时间:2019-07-27 00:58 来源:未知 编辑:admin

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  展开全部在过去,想要发现哺乳动物细胞的重要生理过程,通常需要通过化学突变或将转座子插入到基因组中对细胞内的基因进行干扰。但是,大约10年前,RNA 干扰(RNAi)技术的出现改变了这种状态。这项技术的核心是,设计一个短链RNA,使其在转录过程中与目的基因序列互补结合,从而阻止目的基因翻译成蛋白。RNAi技术的问世,使得对哺乳动物体内每一个细胞内基因进行干扰成为了可能。

  “这个技术的出现开辟了了解哺乳动物基因功能的一个全新领域。”美国国家卫生研究院国家转化科学推进中心从事RNAi筛选的科学家Scott Martin说。利用RNAi筛选方法已经发现了许多关键的细胞过程,如细胞增殖、细胞凋亡和细胞复制等。

  尽管近年来RNAi筛选技术在不断提高,我们拥有了更多有效的RNA探针来干扰目标基因,但是这项技术也存在一定的缺陷。“脱靶效应是主要的限制,” Martin说。你需要采取一定的措施来清除用以沉默靶基因的RNAis而不是靶基因本身,并且还要确保你所选取的靶基因真正参与了某种细胞过程。此外,能正确地选择最适合的文库和筛选方式也是一项挑战。

  为了沉默哺乳动物细胞中的基因,研究人员将21-25个核苷酸长度的双链RNA(siRNA)利用细胞转染的方法导入细胞,在这种导入方法中,siRNA与脂质囊泡结合,通过细胞的内吞作用或膜融合进入细胞内部。被导入的双链RNA解旋后,其中一条链被纳入一个细胞蛋白质复合体,称为RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)。RISC与目标基因结合后分解,这样一来,能与目的基因某一段序列互补的短RNA就能与靶基因某段序列互补结合,从而阻止它们所编码的蛋白质的产生。另外, RNAi也可以通过向病毒导入设计好的短发夹RNA(shRNA)进入细胞并在细胞内复制得以实现。

  因此,进行 RNAi筛选的第一步是搞清楚应该使用siRNA还是shRNA文库。决定这一点的因素之一就是你所要处理的是什么类型的细胞。虽然大多数类型的细胞包括永生化细胞系,使用转染的方式更佳,也有一些只能在悬浮液中生长的细胞类型,例如免疫细胞、某些原代细胞培养和活体组织细胞不适合转染的方法。虽然有一些方法可以帮助siRNA分子进入不能使用转染方法的细胞,如尝试不同的脂类试剂或者代替脂质载体、利用电脉冲来创建瞬态膜孔(电穿孔),但是一些细胞仍然破裂了。在这种情况下,就需要使用shRNA方法。

  siRNA和shRNA之间的选择也可以理解成基因沉默效应持久度的选择。转染后,siRNA在细胞分裂时降解或稀释,一般只持续5天或6天,马萨诸塞州医科大学的助理教授Abraham Brass说道。这个时间应该是足够用来干扰细胞进程,例如细胞周期控制、细胞凋亡和病毒复制。但是,研究较长的细胞过程需要更持久的沉默效应,如衰老和分化,这可能需要几星期的时间才能完成。shRNA可以无限期产生稳态水平的siRNA,因为shRNA通常依赖于逆转录病毒的复制扩增,但这一过程相对较慢。这意味着DNA被整合到细胞基因组中,伴随着细胞分裂继续表达shRNA(虽然病毒经过设计改造,无法传播,但是你仍然需要做好防护工作)。

  两种文库的另一个关键区别是对应的筛选方式不同。一个siRNA在一个排列矩阵中进行:研究人员在多孔细胞培养板进行细胞转染,每一个孔中包含一种设计好的 siRNA,培养后观察每一个孔中的细胞表型。然而这种方法需要约200384个孔的培养板来对人类全基因组的每一个siRNAs进行筛选,花费较高、工作量较大。

  而shRNA可以在一种更简单的筛选方式中运用——shRNA筛选池。这里,将所有的细胞置于约100000种不同的shRNA 病毒载体中。所使用的病毒的数量很低,确保在大多数情况下,一个病毒只“占领”一个细胞,从而只能表达一种类型的shRNA,沉默一个相应的基因。但这一方法的先决条件是在混合物中找出那些细胞,开发这项技术的哈佛医学院遗传学教授Stephen Elledge说。如果基因沉默存活细胞 “成长”,或表达特定的荧光蛋白而“发光”,研究人员都可以通过细胞表型对产生沉默效应的细胞进行区分,随后再对包含有shRNA的不同细胞进行测序,找到引起相应表型的shRNAs。

  目前,市面上有许多用于siRNA筛选的商用文库,包括覆盖整个人类和小鼠基因组的文库和目标基因集文库,但是这取决于你拥有什么样的研究条件。一些设备能提供两种不同的siRNA库排列矩阵,siRNA被分别置于不同的孔中进行靶向结合。但是,在单阵列设备中,所有的siRNA在培养板的一个孔中进行靶向结合。后者因为所使用的耗材更少而更高效。

  一个好的全基因组文库产品,可以专注于一个较小的基因组合,可以将筛选范围缩小,节省时间与精力。要作shRNA筛选,你可以定制自己所需要的文库,无论是病毒形式还是质粒形式。目前可以购买获得两种类型的文库。

  另一种是Thermo Fisher Scientific销售的shRNA文库,叫做shRNAmir,用途是模拟小RNA( microRNA)在细胞内的表达模式。shRNA-mir文库在消除靶基因方面具有一定的灵活性,可以很容易地开启和关闭。而传统的shRNA文库总是令启动子处于开启状态。因此这种文库的可操作性更强。

  “经过siRNA筛选,我们通常不缺乏候选基因,不知道这是好事还是坏事,”NCATS的Martin说。困难的是证明siRNA基因沉默所产生的表型确实是靶基因沉默所致,而非其它意想不到的基因。研究表明,大多数的细胞表型是由于siRNA的脱靶效应所致。为了排除这些干扰,研究者们已经开发设计出了相应统计方案。

  一旦排除了干扰,接下来重要的事情就是额外测试3-5个siRNA或shRNA分子对你所设计的目标基因的沉默效应进行验证。如果多个RNAi分子作用于相同的基因能产生相同的表型,这就说明其效果是真实的,而不是脱靶效应。另一个有说服力的验证技术是“救援实验”,这项技术将siRNA和靶基因的其它拷贝同时导入细胞,而这些拷贝本身带有突变,使得siRNA无法与之结合,如果细胞表型的改变是由siRNA沉默引起的,那么这些拷贝可以恢复表型。而倘若彪形变化不是由基因沉默引起,那么表型保持不变。但是这种类型的实验的困难在于siRNA-拮抗基因表达水平高,反而会影响其正常功能,因此许多多研究人员跳过了此验证步骤。

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